人脑胶质瘤中BMI1 的表达及其意义

　　作者：朱爱华陆华肖新如赵理陈涛刘伟彭小忠袁建刚赵继宗

　　摘要目的：研究基因BMI1在中枢神经系统最常见的肿瘤-胶质瘤组织中的表达情况，并探讨其表达水平与胶质瘤的恶性程度及发生、发展的关系。方法：使用荧光定量实时PCR技术检测基因BMI1在34例各级别胶质瘤手术切除组织及10例正常对照组织中的表达。同时对34例各级别胶质瘤组织及10例正常对照脑组织使用免疫组化的方法检测BMI1蛋白的表达。结果：实时PCR的结果显示，基因BMI1在对照脑组织、Ⅱ级胶质瘤、Ⅲ级胶质瘤及 Ⅳ级胶质瘤组织中的表达相对值分别为0.655、2.65、5.62及5.43。胶质瘤组中BMI1的表达水平显著高于对照组(P=0.001)，恶性胶质瘤组(Ⅲ级与Ⅳ级胶质瘤)中BMI1的表达水平显著高于良性胶质瘤(Ⅱ级胶质瘤)，P=0.015，Ⅲ 级胶质瘤组与Ⅳ级胶质瘤组之间未发现存在差异(P=0.902);免疫组化结果显示，BMI1蛋白在对照脑组织、Ⅱ级胶质瘤、Ⅲ级胶质瘤和Ⅳ级胶质瘤组织中的表达阳性率分别为10%、25%、100%和100%。各级别胶质瘤组织中BMI1 蛋白的阳性表达率显著高于正常脑组织对照组(P=0.001)，而且在恶性胶质瘤组织中BMI1蛋白的阳性表达率显著高于良性胶质瘤(P=0.000)。结论：无论是在mRNA水平还是在蛋白水平上，BMI1在各级别脑胶质瘤标本中的表达水平均明显高于正常脑组织对照，且恶性胶质瘤中BMI1的表达要明显高于良性胶质瘤。BMI1在胶质瘤的发生、发展过程中有重要作用。

　　关键词：胶质瘤 BMI1 实时PCR 免疫组化多梳家族

　　BMI1 是目前研究中最深入的哺乳动物PcG 家族成员。PcG 蛋白―多梳家族蛋白(Polycomb group protein)是一类在染色质水平抑制靶基因转录的蛋白，在胚胎发育、细胞记忆、细胞周期、细胞增殖和肿瘤形成等过程中起到非常重要的作用。胶质瘤是神经系统最常见的肿瘤。BMI1在很多肿瘤中处于高表达的状态，如髓母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、结直肠癌、乳腺癌等。本研究主要采用实时PCR和免疫组化的方法对胶质瘤中BMI1 的表达情况进行检测。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例资料收集

　　2005 年5 月～2005 年10 月北京天坛医院神经外科34 例胶质瘤手术标本，其中男18 例，女16 例;年龄17～62 岁，平均年龄42.3 岁。其中WHO 分级Ⅱ级星形细胞瘤12 例，Ⅲ级间变星形细胞瘤12 例，Ⅳ级胶质瘤母细胞瘤10 例。同时收集对照脑组织标本共10 例，包括脑外伤组织、瘤旁组织、内减压脑组织、癫痫切除颞角组织等。

　　1.2 实时PCR

　　采用提取总RNA 试剂盒(美国Invitrogen 公司)从所有组织中提取全部RNA，然后使用MMLV(反转录酶)试剂盒(美国Biolabs 公司)将所有的RNA 转化为cDNA。实时PCR 仪为Applied Biosystems，ABI 7500 型，PCR 反应混合溶液为10μl SYBR Green PCR 预混试剂(ABI 公司)，1μl 稀释的模板，2μl 引物对(5μM)，7μl 无菌去离子水，每种引物，每种模板，各3 个平行管反应。BMI1 引物对为5'-ATTCTA CCAGTCCCGAGGTTTG-3'，5'-GGTTCAACTGCTCA TCATAGCG-3';内参基因GAPDH 引物对为，5'-CA TCCATGACAACTTTGGTATC-3'，5'-CCATCACGCC ACAGTTTC-3'。Real-time PCR 反应程序：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min。循环重复第2、3 步40 次。计算同一个样品BMI1 的Ct 值与GAPDH 的Ct 值的比值，取3 个平行孔Ct 比值的平均数。做图时将正常组织的Ct 比值的平均数设为1.0，计算出所有样品的相对值后制图。

　　1.3 免疫组化

　　BMI1 免疫组化检测采用SP 法：石蜡切片脱蜡至水，抗原修复后，分别加入3%过氧化氢和5%～ 10%正常山羊血清，孵育后加入鼠抗人单克隆抗体(中杉生物技术有限公司)，最后再分别加入二抗和辣根酶标记链霉卵白素，用DAB 染色，苏木精复染，常规脱水封片。即用型SP 试剂盒和液体DAB 酶底物显色试剂盒购自中杉生物技术有限公司。阳性判断：以瘤细胞内出现棕褐色颗粒为阳性，瘤细胞无棕褐色颗粒为阴性(-)，阳性细胞数<25%为弱阳性(±)，阳性细胞25%～50%为阳性(+)，阳性细胞>50%为强阳性(++)。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 11.5 统计软件，对实时PCR 数据行独立样本t 检验。对免疫组化数据行所有的P 值均双侧检验，P≤0.05 为具有统计学意义。免疫组化数据采用χ2精确概率法检验。

　　2 结果

　　2.1 BMI1 mRNA在胶质瘤及正常对照组织中的表达见表1。结果显示胶质瘤中BMI1 的表达明显高于对照组织(t=-3.73，P=0.001)，Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中BMI1 的表达也明显高于Ⅱ级胶质瘤(t=-2.57， P=0.015)。但是在Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤之间未发现表达差异(t=0.12，P=0.902)。

　　2.2 BMI1 蛋白在胶质瘤及正常对照组织中的表达

　　BMI1 阳性表达细胞呈散在分布，BMI1 阳性染色位于瘤细胞细胞核中，棕褐色，其阳性表达的程度随肿瘤恶性程度的增加而有所增加，在恶性脑胶质瘤组织中明显高于良性胶质瘤(图1)。

　　见表2。结果显示在肿瘤组中BMI1 蛋白的表达要明显高于对照组(χ2=11.733，P=0.001);Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中BMI1 的表达要高于Ⅱ级胶质瘤(P=0.000)。

　　3 讨论

　　鼠BMI1 基因定位于10p13，在人类位于 10p11.23。BMI1 基因编码一个45kD 的蛋白，在胚胎干细胞、胎盘、胸腺、心脏、睾丸和脑组织中广泛表达。人们很早就认识到BMI1是一种癌基因，它与原癌基因c-Myc 协同作用，引起淋巴瘤的形成。 BMI1 对小脑的发育很重要，BMI1 基因敲除的小鼠神经系统有显著改变，BMI1 能促进神经干细胞的增殖，使造血干细胞保持增殖能力。近年，人们进一步认识到BMI1 是通过抑制INK4a 和ARF 编码蛋白，调控细胞周期、细胞衰老以及神经干细胞的自我更新能力。

　　肿瘤抑制基因座INK 4a/ARF是BMI1的靶位点，这一基因座因为读码框不同而编码两种结构各异的肿瘤抑制蛋白p16INK4a 和ARF。在人类癌症中，INK4a/ARF 基因座是经常发生突变、删除和表观沉默的靶点。近年在人类癌症研究中发现BMI1 在一些血液系统疾病如非霍奇金淋巴瘤中扩增。BMI1 表达的失控不仅局限于血液肿瘤。大量研究均显示BMI1 在各种实体瘤肿瘤的形成中起着重要作用，如髓母细胞瘤、乳腺癌、和近年发现的肝癌、结肠直肠癌等，BMI1 均明显高表达。而且，多样本分析表明BMI1 的过表达还与导管性乳腺癌的腋窝淋巴结转移有关，这揭示BMI1 可能参与了恶性肿瘤的进展和转移。BMI1 蛋白的高水平表达还可以抑制前列腺癌细胞的凋亡，可以使前列腺癌细胞在转移过程中更好地存活，从而更好地在血循环中形成转移前体细胞团，这可能正是BMI1 促进恶性肿瘤的进展和转移的原因所在。研究同时还发现BMI1 阴性的恶性肿瘤患者的预后明显好于 BMI1 阳性患者。目前国外已有研究证实BMI1 阳性的恶性胶质瘤患者的2 年生存率明显低于BMI1 阴性的恶性胶质瘤患者。另一研究认为，BMI1 的高表达可以作为判断少枝胶质细胞瘤和少枝-星形细胞瘤预后的一个独立的指标，但与星形细胞瘤和胶质母细胞胞瘤的预后无相关性。

　　胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的肿瘤，具有发病率高、复发率高、死亡率高以及治愈率低等特点，目前对于胶质瘤的治疗包括手术治疗、术后放疗、化疗、基因治疗以及免疫治疗等综合治疗，其中基因治疗是最有前景的方法之一。本研究通过对34 例胶质瘤标本和10 例对照标本使用实时 PCR 的结果显示，胶质瘤中BMI1 的表达显著高于正常对照组，而且在恶性胶质瘤中，BMI1 的表达高于良性胶质瘤。通过免疫组化的结果我们可以看出， BMI1 仅在胶质瘤瘤细胞的细胞核中表达。胶质瘤组中BMI1 的表达要显著高于正常对照组，随着胶质瘤级别的增高，BMI1 蛋白在胶质瘤中的表达存在增强的趋势，恶性胶质瘤中BMI1 蛋白的表达要显著高于良性胶质瘤。实时PCR 的方法和免疫组化的方法得出的结论相互吻合，这说明BMI1 对于胶质瘤来说也是一个癌基因。本研究发现BMI1 基因与胶质瘤的形成及恶性程度存在着一定的联系，很可能参与胶质瘤恶变的某些环节。 BMI1 在胶质瘤中的分子作用机制还需要进一步研究，需要在胶质瘤细胞系中进一步验证，而且我们还可以研究该基因与胶质瘤放化疗敏感性的相关性，及与胶质瘤预后的关系。在目前胶质瘤手术结合放、化疗效果不佳的情况下，也许可以为胶质瘤的基因治疗提供一个新的靶点选择。

　　来自中国肿瘤临床2009年第36卷第11期