三阴性乳腺癌干细胞微球体的治疗
三阴性乳腺癌干细胞微球体的治疗
作者：赵乐 梁晨 李倩 裴晓华
[摘要] 三阴性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人类表皮生长因子受体2 （HER一2）均为阴性的乳腺癌。TNBC恶性程度高，侵袭性强，易远处转移，预后差，对内分泌治疗及靶向治疗的效果均欠佳，是临床治疗的难点。近几年研究发现，三阴性乳腺癌的发生、发展很可能与其中的乳腺癌干细胞有关，乳腺癌干细胞微球体培养是一种收集干细胞的方法，被广泛用于三阴性乳腺癌的干细胞研究。
[关键词] 三阴性乳腺癌；乳腺癌干细胞；微球体
在所有类型的乳腺癌中，三阴性乳腺癌（triple— negative breast cancer，TNBC）约占15%，绝经前的非洲裔美国妇女和西班牙妇女有较高的发病率。TNBC容易发生局部复发和远处转移，而且内脏转移率高于骨转移率。TNBC的组织学类型大部分表现为导管癌（约70%），还有纯小叶癌、混合癌及髓样癌，其中髓样癌预后较好。TNBC肿瘤直径大，常有推挤性边缘和中央坏死。病理学类型主要为侵袭件导管癌和化生性癌，组织学分级高，多为低分化。化疗是TNBC主要的治疗手段，但缺乏大规模多中心针对TNBC化疗的临床研究，内分泌治疗和针对HER.2受体的靶向治疗TNBC也是不敏感的，其他治疗靶点尚处于探讨阶段。目前国内尚没有TNBC的专门治疗指南，因此，临床急需好的治疗思路和有效药物。干细胞微球体研究的出现成为解决三阴性乳腺癌这个临床难题良好的切入点，现将近年来国内外三阴性乳腺癌干细胞微球体治疗研究进展综述如下。
1.三阴性乳腺癌与肿瘤干细胞
1.1 肿瘤干细胞及乳腺肿瘤干细胞的定义及特点：人们将肿瘤组织中致瘤能力强、有分化潜能和自我更新的细胞称为肿瘤于细胞（cancer stem cells，CSCs 或tumor stem cells，TSCs）。1997年Bonnet等∞1将少量具有干细胞特性的白血病细胞成功转染至 NOD/SCID系小鼠，从而证明了人类白血病起源于白血病干细胞。这种研究迅速扩展到乳腺癌及其他实体肿瘤。
乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells， BCSCs）是指存在于乳腺肿瘤内的极少数具有干细胞特性，可能是乳腺癌起源、复发与转移真正原因的细胞。2002年Clarke等冲。把乳腺癌切除手术后的标本制成单细胞悬液，经流式细胞仪筛选出表达 CD44、B38.1、ESA的细胞，扩增后同样注入NOD/ SCID小鼠体内后小鼠长出了肿瘤，证明这部分细胞具有乳腺肿瘤源性。随后，A1一Hajj等把在乳腺癌组织中表型为CD44+/CD24一的细胞注入NOD/SCID系小鼠体内，仅需100个细胞就可以形成乳腺肿瘤，而其他表型的细胞即使用2×104个也未形成乳腺肿瘤，提示其具有干细胞特性。然而，Honeth 等研究表明，不是所有类型的人乳腺癌组织中都含有CD44+/CD24一细胞，如HER一2乳腺癌患者很少含有该表型细胞，提示乳腺癌干细胞的其他表面标志有待进一步测定。但目前研究认为，CD44+/ CD24一可作为导致乳腺癌的肿瘤起始细胞。只是在不同的乳腺癌细胞系中CD44+/CD24所占比例差别很大，从在MCF7细胞系中CD44+/CD24一所占比例的1%到MDA—MB一231细胞系中的90%。Schmitt等提出，在今后的研究中有必要建立一组完整的BCSCs表面标志，以便让CSCs的研究成果更好地运用到乳腺癌的防治中。
1.2 干细胞研究方法对三阴性乳腺癌有重要价值：与其他类型的乳腺癌相比，TNBC更适合于干细胞的研究。研究发现，ALDHl+及CD44+/CD24表型在不同亚型乳腺癌中的表达率存在显着差异，其中TNBC两者的表达率以及形成乳腺癌干细胞球的效率均高于非三阴性乳腺癌，提示在TNBC中存在较高比例的f细胞，这可解释其预后差、易复发转移、恶性程度高等特点。魏素菊等在研究晚期转移性三阴性乳腺癌中也发现，正常培养条件下 TNBC细胞系MDA—MB-231中CD44+/CD24细胞比例为（86.46±4.72）%，同时发现，在培养条件相同的情况下，CD44+/CD24细胞含量相对稳定。化疗可以使TNBC患者外周血中CD44+/CD24一细胞含量降低。
2.三阴性乳腺癌干细胞微球体
2.1 乳腺肿瘤与干细胞微球体：BCSCs的存在是乳腺癌复发和转移的根源，故只有把治疗靶向目标聚焦于BCSCs，才能有望实现乳腺癌的彻底根治。虽然有关BCSCs的研究发展非常迅速，但是这一新兴的研究领域尚有许多有待解决的问题，首先是如何筛选和富集肿瘤干细胞。由于BCSCs在乳腺癌原发肿瘤中含量极低，因此，如何分离获取BCSCs，研究其可能的调控机制和生物学行为，对于了解乳腺癌的诊断和预后，明确乳腺癌的发病机制，制定乳腺癌的个体化的治疗方案以致最终根治乳腺癌有着重要意义。目前富集乳腺癌干细胞的主要方法有抗体分选CD44+/CD24一细胞、流式细胞仪分选侧亚群细胞及乳腺癌细胞微球体（mammosphere，MSs）培养等。
微球体培养是一种常用的富集肿瘤干细胞的方法，其最初是用于神经系统肿瘤于细胞的富集。随后发现，在正常乳腺组织中，MSs具有多向分化、自我更新、重建乳腺组织等干细胞特有的功能。Matthew等培养从乳腺癌患者胸腔积液中转移来的肿瘤细胞，形成微球体后转染至小鼠，在20只重症联合免疫缺陷（sever combined immunodeficient，SCID）小鼠中有17只产生肿瘤。说明微球体培养的方法可以有效富集BCSCs。而且，微球体培养法在无需知道特异的细胞表面标志的情况下便可以有效富集肿瘤干细胞，是一种相对经济有效的方法。这些细胞球（微球体）是一种很引人注目的干细胞模型。
2.2三阴性乳腺癌与干细胞微球体
2.2.1 三阴性乳腺癌细胞系MDA—MB一231通过微球体培养可以获得稳定数量的肿瘤干细胞：细胞系MDA—MB一231的雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2表达均为阴性。MDA—MB一231是1974年Cailleau等从乳腺癌病人胸腔积液中培养建立的。它属于问充质样（mesenchymal—like）乳腺癌细胞系，具有高侵袭性和高转移性、分化差、恶性度高等特点，其体内外生物学特性与TNBC最为接近。应用乳腺癌细胞系MDA.MB一231来寻找靶向治疗BCSCs的药物，具有很高的可重复性。1?。而且通过微球体培养可以获得稳定数量的BCSCs。
2.2.2 三阴性乳腺癌细胞系CAL一51和BT一20经干细胞培养后可见明显的微球体形成：与其他细胞系相比，三阴性乳腺癌细胞系更适合干细胞培养，形成微球体的能力强于非三阴性乳腺癌细胞系。最新研究，由10种乳腺癌不同亚型细胞系制成单细胞悬液，在肿瘤干细胞培养基中进行悬浮培养，经干细胞培养基筛选后，其中仅有两种三阴性乳腺癌细胞 CAL一51和BT一20可观察剑明显的微球体形成，其余细胞系培养至4周以上仍未观察到明显的微球体形成。这些结果提示，通过微球体培养方法可有效富集三阴性乳腺癌干细胞。
CAL一51细胞在培养第5天时可观察到绝大部分细胞裂成碎片或皱缩，少部分细胞呈球状生长 （约5%），中问密度较高，折光性较好，至培养第7天则可见体积更大、更加致密的微球体形成，并且可以进行稳定传代。BT-20细胞则在培养第3天即可观察到成球生长的细胞（约20%），第4～5天则可见悬浮生长、致密的微球体形成，也可以进行稳定传代，说明在于细胞培养基中肿瘤细胞微球体中的细胞能够存活并具有自我更新能力。
2.2.3微球体培养方法在三阴性乳腺癌研究中的运用
2.2.3.1 三阴性乳腺癌干细胞特异性药物的研究： TNBC的早期复发可能是因为存在肿瘤起始细胞 （tumour.initiating cells，TICs）即肿瘤干细胞。TICs 对传统治疗产生抵抗，保持静止休眠，随后引起肿瘤复发。这些特种细胞有自我更新的能力，能够形成微球体最后发展成肿瘤，促使肿瘤复发的助燃剂是在放疗和化疗中启动了TICs，因此治疗TNBC的新药必须解决这个问题。
沙利度胺（thalidomide，TLD）对三阴性乳腺癌干细胞微球体有干预作用。耿杰等采用三阴性乳腺癌MDA—MB一231细胞系的微球体的培养，以紫杉醇为对照，研究TLD对三阴性乳腺癌干细胞 （TNBCSCs）微球体的干预情况。结果表明，与空白对照组相比，TLD处理后的微球体形成率明显减少，同时干细胞的增殖、侵袭能力均降低，血管内皮生长因子（VEGF）的表达下降明显。
咖啡酸苯乙基酯（caffeic acid phenethyl ester， CAPE）提取自蜂胶，有抗肿瘤的作用。Omene等假设CAPE通过埘肿瘤干细胞发挥调节作用，他们从MDA.MB.231细胞和鼠移植肿瘤中分别分离乳腺肿瘤干细胞。MDA.MB一231细胞是一种人TNBC 的细胞模型，BCSC采用微球体培养方式。结果表明，软琼脂内CAPE预处理导致微球体的生长受到抑制，微球体显着减小，CAPE和微球体之间还有时间依赖性和剂量依赖性。曲尼司特（tranilast）
曲尼司特（tranilast）用于支气管哮喘。Prud' homme等。2副研究其抗肿瘤作用，它对HER一2（+）乳腺癌及三阴性乳腺癌有显着作用。曲尼司特可以阻止干细胞微球体的形成，还可以促进其裂解。在曲尼司特的抑瘤作用中芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR）具有关键作用，siRNA沉默AHR或者使用AHR抑制剂后，曲尼司特就完全没有了抗干细胞微球体形成的作用。
2.2.3.2针对三阴性乳腺癌的信号传导机制：通过观察微球体可以找出乳腺癌发生发展的重要信号通路。自从Notch信号通路在乳腺原位癌中被发现，它的异常激活被认为很有可能是乳腺癌发生的始动因素。在乳腺癌中高表达Notch.1和较差的预后有密切联系；用于阻挡Notch信号通路的γ分泌酶抑制剂或者Notch-4抗体中和剂都能有效减少乳腺原位癌中的干细胞微球体心。阻断Notch信号通路有望成为治疗三阴性乳腺癌的有效靶点。Qiu等悼纠提出，Notch信号通路在CSCs的自我更新和变异中具有重要角色，因此有希望针对性地采用新的治疗方法进行治疗，如像TNBC这样高侵蚀性的癌症。他们的研究表明，Notchl单克隆抗体（mAbs）引起微球体和细胞群CD44+/CD24一的减少，因此，利用这种方法就能减少TNBC的转移和复发。
2.2.3.3三阴性乳腺癌的化疗：与其他类型的乳腺癌相比，三阴性乳腺癌对化疗也有较好的反应率，但如果只是常规的标准治疗，其预后依然很差。需要找出适合其特点的特殊治疗方案。
Arima等研究三阴性乳腺癌的免疫组织化学临床组织病理片显示，细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂P16（cyclin—dependent kinase inhibitor P16）低表达与术前化疗无效有关，他们发现P16的表达可以抑制ER（一）乳腺癌细胞系微球体生长；并且消耗掉 P16后引起肿瘤的化疗敏感性降低。因此，P16低表达的三阴性乳腺癌通过其干细胞的抵抗作用对化疗有较低应答率。
尽管三阴性乳腺癌对新辅助化疗有较高的反应率，但其仍有较高的复发率和较差的预后。Yin 等通过实验发现，顺铂（cisplatin）联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对三阴性乳腺癌干细胞的作用最强。顺铂加TRAIL可以阻挡Wnt一1 信号通路以及它的下游靶点，从而促进细胞凋亡，减少细胞细胞扩增，还会抑制干细胞微球体的生长。与对照组比较，通过siRNA阻断Wnt一1信号通路可见CSCs形成微球体的能力明显降低。
2.2.3.4三阴性乳腺癌的基因靶向治疗：Polo样激酶1（Polo—like kinase 1，Plkl）基因参与有丝分裂的全过程，是调控细胞增殖的关键酶。相关研究表明，多种肿瘤与Plkl的过表达相关，而抑制Plkl基因可以促进肿瘤细胞凋亡。Hu等用siRNA（small interfering RNA）或者BI 2536沉默了P1K1后，表型 CD44+/CD24一的肿瘤起始细胞（TIC）和微球体的生长受到了明显抑制，从而阻止了三阴性乳腺癌的形成与发展。因此，P1K1可以作为三阴性乳腺癌潜在的靶向治疗方法。Liu等通过单变量分析和多变量分析表明，Oct-4和Nestin不仅和患者年龄、病情程度、淋巴结转移有显着的联系，还和TNBC较小存活率有很大联系。而他们采用干细胞微球体的体外培养发现，Oct-4和Nestin有很强的致瘤性。Oct. 4和Nestin在乳腺癌的发展中发挥重要的调控作用，因此，有可能作为TNBC预后的预测因子。
3.结论与展望
综上所述，TNBC是现代医学治疗的难点，而肿瘤干细胞的研究为TNBC的治疗带来了希望，但是干细胞在乳腺癌原发肿瘤中含量极低，如何分离获取乳腺肿瘤成为此研究的关键，而微球体培养方法可以有效富集乳腺肿瘤干细胞。因此，近几年在乳腺癌的各种研究中广泛运用了微球体培养方法。可喜的是，三阴性乳腺癌细胞系形成肿瘤干细胞球的能力强于非三阴性乳腺癌细胞系，说明此种方法是 TNBc的较好选择，而且干细胞微球体可以作为体外研究TNBc的细胞模型。迄今为止，在人们还没有了解三阴性乳腺癌干细胞复杂多变的机制，却具备干细胞微球体有效方法的情况下，“以法测药”，寻找到其更为敏感的药物以及作用的细胞学机制将成为今后TNBc治疗研究的热点。
来自：解剖学报第44卷第3期
