乳腺癌端粒酶活性与PCNA表达关系

作者：张斯，于秀婷，孟凡，

【关键词】乳腺癌；端粒酶；增殖细胞核抗原；多聚酶链式反应；免疫组织化学

摘要：目的探讨端粒酶活性与增殖细胞核抗原（PCNA）表达之间的关系及联合检测对乳腺癌术后治疗方案制定和预测预后的意义。方法采用端粒重复序列扩增聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定法（TRAP-PCR-ELISA）和免疫组织化学链霉素生物蛋白过氧化物酶（S-P）法对80例乳腺癌组织、36例乳腺癌相应癌旁组织和10例乳腺良性病变的端粒酶活性及增殖细胞核抗原进行检测。结果（1）80例乳腺癌患者癌组织标本、36例乳腺癌相应癌旁组织标本中端粒酶表达阳性率分别为650%和83%，差异有统计学意义（P<001）；10例乳腺良性病变组织标本中未检测出端粒酶活性；腋窝淋巴结有无转移与端粒酶阳性表达率差异无统计学意义（P>005）。（2）80例乳腺癌组织中PCNA的阳性表达率为6375%;乳腺癌有淋巴结转移组PCNA阳性表达率显着高于无淋巴结转移组（P<001），且呈正相关（P<001），即淋巴结转移程度越低，PCNA阳性表达率亦越低。（3）端粒酶活性与PCNA表达具有一致性（P<001），且呈正相关（P<001），一致率为8625%。结论端粒酶活性与PCNA表达具有一致性，端粒酶活性与PCNA联合检测，可为乳腺癌术后治疗方案的制定和预测预后提供辅助依据。

关键词：乳腺癌；端粒酶；增殖细胞核抗原；多聚酶链式反应；免疫组织化学

增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）是一种表达细胞增殖周期的36kd多肽，直接参与细胞增殖过程中DNA的复制，其表达程度能客观反映肿瘤细胞的增殖活性，过度表达增加了瘤细胞转移趋势的危险性，PCNA可作为判断肿瘤预后的指标〔1〕。为探索乳腺癌组织端粒酶活性与增殖细胞核抗原表达的关系，对80例乳腺癌组织、36例乳腺癌相应癌旁组织和10例乳腺良性病变的端粒酶活性及增殖细胞核抗原进行检测。

1 对象与方法

11 对象收集我院1992～2002年女性乳腺癌根治标本病理检查存档资料80例，乳腺癌相应癌旁组织（距离肿瘤2cm以上）36例，年龄32～72岁，平均年龄4846岁；乳腺良性病变10例，平均年龄3850岁。全部资料经2位病理医师审核，患者术前未做过放、化疗。乳腺癌分类根据“中国常见恶性肿瘤诊治规范”分为非浸润性癌、早期浸润性癌、浸润性特殊癌、浸润性非特殊癌4类。

12 试剂与仪器端粒多聚酶链反应-酶联免疫吸附（Telomerase PCR ELISA）试剂盒（德国Boehringer Mannhein公司）；阳性对照为肿瘤293细胞株（检测试剂盒提供）；阴性对照为不含蛋白的裂解液；Ⅰ抗PCNApc10和链霉素生物蛋白过氧化物酶（S-P）试剂盒及过氧化物酶底物作用液二氨基联苯氨（Diaminobenzidine,DAB）（北京中山生物技术有限公司）；用已知乳腺癌组织阳性切片（北京中山生物技术有限公司）为阳性对照，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）代替Ⅰ抗做阴性对照。酶标仪（SPECTRAⅢ）（美国Dynex公司）PCR（T-1 thermoblock）（德国Biometra公司）。

13 端粒酶活性检测（1）端粒酶提取：每份标本用病理切片机切10～15μm厚50片，加入预冷的端粒酶裂解液20μl，放置冰上裂解30min，1600r/min 4℃离心20min，取175μl上清液为提取液，放置于-80℃冰箱中保存备用。（2）端粒酶活性检测：端粒重复序列扩增-多聚酶链反应-酶联免疫吸附（TRAP-PCR-ELISA）法〔2，3〕，取细胞提取液1～2μl加入25μl端粒重复序列扩增-多聚酶链反应（TRAP PCR）扩增液；无菌二乙基焦碳酸酯（diethyprocarbonate,DEPC）水补足至体积50μl混匀；在PCR扩增仪上按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：95℃ 5min预变性，再以94℃ 30s变性、50℃ 30s退火、72℃ 90s延伸，共循环30个周期，最后72℃延伸10min。取上述PCR产物5μl加变性试剂20μl混匀，置室温10min;加入杂交液225μl混匀后取出100μl移至包被于抗地高辛的酶标板中室温作用2h;加入抗地高辛过氧化物酶并与底物作用30min后终止反应。用酶标仪测其在波长450nm的吸光度（A）值。

14 PCNA检测采用免疫组织化学S-P法染色，按试剂盒说明书操作：所有标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片。二甲苯脱蜡，梯度酒精至水化后高压锅热处理5～8min，过氧化物酶阻断血清封闭，加Ⅰ抗60min，PBS液洗3次，每次2min;Ⅱ抗15min，PBS液洗3次。每次2min;Ⅲ抗同Ⅱ抗。DAB显色5～10min，苏木素复染5～10s，脱水，透明胶封片。

15 结果判断端粒酶以吸收度（A）>020为阳性判断标准。PCNA以细胞核内出现清晰的棕色或棕黄色颗粒为阳性诊断标准，每例切片至少观察5个高倍视野。

16 统计分析采用SPSS100软件对各组端粒酶及PCNA阳性表达率进行χ2检验，Fisher确切概率检验和Kendall等级相关分析。

2 结果

21 各部位端粒酶活性表达及与淋巴结转移的关系 80例乳腺癌患者癌组织标本端粒酶表达阳性率为650%（52/80）；36例乳腺癌相应癌旁组织标本端粒酶表达阳性率为83%（3/36）；10例乳腺良性病变组织标本中未检测出端粒酶活性。各部位端粒酶阳性表达率总体差异有统计学意义（P<001），但进一步分析，癌组织与癌旁相应组织、癌组织与良性病变组织端粒酶阳性表达率差异有统计学意义（χ2=31975，P≤0001;χ2=15395，P≤0001），而癌旁相应组织与良性病变组织端粒酶阳性表达率差异无统计学意义（P>005）；端粒酶阳性表达率与部位呈正相关（rs=055,P<0001）。端粒酶阳性表达率与腋窝淋巴结转移之间差异无统计学意义（χ2=2473，P>005）。

表1 PCNA阳性表达率与乳腺癌组织类型及淋巴结转移的关系（略）

注：* P<005,** P<001;rs Kendall等级相关系数

22 PCNA与乳腺癌组织类型及淋巴结转移的关系（表1）在80例乳腺癌标本中，PCNA的阳性表达率为6375%（51/80）。其中有淋巴结转移且PCNA阳性表达的为39例，无淋巴结转移且PCNA阳性表达的为12例；有淋巴结转移组PCNA阳性表达率显着高于无淋巴结转移组（P<001），且呈正相关（P<001），即淋巴结转移程度越低，PCNA阳性表达率亦越低。组织类型与PCNA阳性表达率呈正相关（P<005），即肿瘤恶性程度越高，PCNA阳性表达率亦越高，但各组间差异无统计学意义（P>005）。

23 PCNA表达和端粒酶活性之间的关系（表2）端粒酶活性与PCNA表达具有一致性（χ2=3926，P<001），且呈正相关（rs=0643,P<001），即端粒酶活性阳性表达率高，PCNA阳性表达率亦高。一致率为8625%[（46+23）/80]。

表2 PCNA表达和端粒酶活性之间的关系（略）

3 讨论

研究表明，几乎所有的永生细胞和绝大部分恶性肿瘤组织均有明显的端粒酶活性，而正常细胞、部分良性肿瘤组织和非永生细胞系中则无或仅有极低的端粒酶活性〔4〕。本研究结果显示，乳腺癌患者癌组织标本端粒酶阳性表达率显着高于乳腺癌相应癌旁组织和乳腺良性病变组织，而乳腺良性病变组织中无端粒酶活性的表达。端粒酶阳性表达与腋窝淋巴结转移无关。上述结果与俞乔〔5〕报道一致。有文献报道〔6〕，瘤细胞增殖活性高者，PCNA高表达，易发生淋巴结转移，说明PCNA过度表达增加了瘤细胞转移的危险性。本研究结果显示，PCNA阳性表达率在乳腺癌淋巴结有转移组与淋巴结无转移组分别为750%和4286%，差异有统计学意义（P<001）；且PCNA阳性表达率与淋巴结转移情况呈正相关（P<001）。PCNA阳性表达率与乳腺癌组织类型间虽呈一定的正相关（P<005），但各组间PCNA阳性表达率差异无统计学意义（P>005），可能与本次研究样本量较少有关。另外，本结果显示，端粒酶活性与PCNA表达具有一致性且呈正相关，说明端粒酶活性阳性表达率高，PCNA阳性表达率亦高，2者具有协表达的关系，临床上可将端粒酶检测及PCNA表达结合起来，为指导治疗或预测预后提供辅助依据；同时通过阻断端粒酶活化亦可达到预防和治疗肿瘤的目的。